Histolojik çalışmalar, canlılardan alınan dokuları bir dizi işlemden geçirilerek elde edilen doku kesitlerinin histo-patolojik yönden değerlendirilmesini kapsamaktadır. Dokular, mikroskopta incelenebilir hale gelene kadar yaklaşık 1 haftalık bir süreçten geçmektedir. Genellikle 5 aşamadan oluşur. Bu aşamalar; tespit (fiksasyon), doku takibi, blok hazırlama, kesit hazırlama ve boyama işlemidir. Tespit aşamasında dikkat edilmesi gereken nokta olabildiğince hızlı ve dokuyu bozmadan stabil hale getirebilmektir. Fiksasyonun temel amacı ise hücre ölümlerinin durdurulması, bakteriyel hasarın yani çürümenin önlenmesi, canlının yapısına benzer şekilde muhafaza edilmesini sağlamak ve daha sonra uygulanacak boyama, inceleme, takip işlemlerine dayanıklı hale getirebilmektir. Fiksasyon esnasında dokunun türüne göre farklı solüsyonlar kullanılabilir. Alınan dokular genellikle %10’luk formaldehit solüsyonunda 1 gece bekletilmektedir. Ardından akan suyun altında birkaç saat yıkamaya bırakılır. Bu aşamadan sonra doku takibine geçilir. Doku takibi de 3 aşamadan oluşmaktadır. İlk olarak dehidratasyon (suyunu alma) aşamasında dokuların içindeki suyun alınması gerekmektedir. Bunun için alkol serisinden geçirilir. En çok kullanılan dehidratasyon çözeltileri aseton ve etanoldür. Doku, artan çözelti konsantrasyonlarında (genellikle %50-70 ile %100 arası) belli sürelerde bekletilir. Bekletilen süre dokunun türüne ve incelenmek istenilen özelliğe göre değişebilir. Dehidratasyon işleminden sonra dokuyu saydamlaştırmamız gerekmektedir. Saydamlaştırma işlemi için alkolden alınan dokular ksilolün içine koyulur. Bu aşamada ksilolden farklı olarak benzen, toluen veya kloroform gibi maddeler kullanılabilir. Ksilolün kullanılma amacı ise dokuda bulunan yağları eritmesi ve dokunun saydamlaşmasını sağlamasıdır. Doku takibinin son aşaması olarak parafinizasyon yapılır. Bu aşamada ise dokular erimiş parafinin içerisinde bekletilir. Bu sayede dokularda bulunan ksilol yerine parafin geçirilir. Blok hazırlama (gömme) işleminde ise dikdörtgen prizmalar içerisine dokular yerleştirilir. Yerleştirilirken dikkat edilmesi gereken konu ise dokunun incelenmek istenilen bölümü alt kısma getirilmelidir. Dokular yerleştirildikten sonra üzerine sıcak parafin dökülür ve soğumaya bırakılır. Belli bir süre bekledikten sonra parafin ve dokular sertleşir. Ardından mikrotom adı verilen cihaz sayesinde 1-10μm kalınlığında kesitler alınır. Alınan kesitler 35-40oC sıcaklıktaki distile suya bırakılır. Dokuların lama daha iyi yapışabilmesi için suyun içerisine jelatin de eklenebilir. Sıcak suyun içerisinde parafin eriyecektir ve dokular kalacaktır. Kalan dokular da lama alınır. Dokuların lama iyice yapışması ve kuruması için beklenmesi gerekmektedir. Ardından boyama işlemine geçilebilir. Boyama için kullanılan farklı yöntemler vardır ancak histolojik boyalar içerisinde en sık kullanılan hematoksilen-eosin birleşik boyama yöntemidir. Lam üzerine alınan doku kesitinin boyanabilmesi için parafinden tam olarak kurtulması gerekmektedir. Bunun için preparatlar ksilol içerisinde bekletilir. Daha sonrasında saf alkolden başlayarak alkol serisinden geçirilir. Artık preparatlar belirlenen yönteme göre boyanabilir. Peki nasıl bir boya dokuları boyayabilir? Hematoksilen tek başına dokuyu boyayamaz. İlk olarak okside olur ve aktif formu olan Hemathein’e dönüşür. Alkali pH değerine sahip hematoksilen çekirdeği (nükleik asit) ve kalsiyum çöküntülerini mavi-mor renge boyar. Bu boyama esnasında asit-baz tepkimesi gerçekleşir ve tuz oluşur. Benzer bir şekilde eosin ise asidik bir pH değerine sahiptir ve sitoplazma, protein, lizozom gibi yapıları boyar. Boyama işlemi bittikten sonra örnekler entellan adı verilen özel bir maddeyle kapatılarak kurumaya bırakılır. Boyama işleminin asıl amacı ise dokuların net bir şekilde görülebilmesini ve ayırt edilebilmesini sağlamaktır. Çünkü dokular genellikle renksiz görünmektedir. Bu sebepten dolayı mikroskop altında inceleme yapılırken zorluk oluşturulabilir.
Herhangi bir canlıdan alınan dokular bu yolculuğu tamamladıktan sonra incelenmeye hazır hale gelmiş olur.
Editör : Merve Koçoğlu