Karmaşık bir numune içerisindeki spesifik bir proteini elde etmek için çeşitli yöntemlere başvurabiliriz. Bunlara protein saflaştırma yöntemleri denir. Peki neden proteinleri saflaştırmaya ihtiyaç duyarız? Bir proteinin işlevini, yapısını, diğer proteinlerle etkileşimlerini incelemek ya da karakterizasyonu hakkında bilgi sahibi olmak istiyorsak saflaştırma işlemi şarttır.
Bir proteini saf olarak izole edebilmek oldukça zordur. Günümüzde bu işlem için çok çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Her proteinin özelliğine göre (amino asit dizilişi, molekül ağırlığı, diğer fiziksel özellikleri vb.) birçok yöntem arasından en uygun olanı seçilmelidir. İlk olarak saflaştırmak istediğimiz proteinin en fazla bulunduğu doku seçilir. Daha sonrasında saflaştırma yöntemlerinden biri veya birkaçı uygulanarak proteinin saf hali ya da safa yakın hali elde edilir.
Bazı protein saflaştırma yöntemleri şu şekildedir:
· Kromatografik Yöntemler
a) Jel Filtrasyonu
b) İyon Değiştirici (Ion Exchange) Kromatografisi
c) Afinite Kromatografisi
· Elektroforetik Yöntemler
a) Elektroforez (SDS-PAGE)
b) İzoelektrik Fokuslama
· Santrifügasyon Yöntemleri
a) Density Gradient (Zonal) Santrifügasyon
b) Diferansiyel Santrifügasyon
· Dializ ve Ultrafiltrasyon
Kromatografi, çeşitli saflaştırma işlemlerinde kullanılmaktadır. İlaç endüstrisinden gıda endüstrisine, çevre analizlerinden biyokimyasal analizlere kadar birçok alanda kullanılmaktadır. Protein saflaştırma için de sıklıkla başvurulan bir yöntemdir. Kromatografi, ayrıştırılmak istenen bileşenin biri hareketli diğeri sabit iki faz arasında ayrılması ve saflaştırılması esasına dayanır. Bazı bileşenler fazlar içinde yavaş hareket ederken bazıları da hızlı hareket eder. Bu sayede karışımın bileşenleri birbirinden ayrışmış olur. Damıtma ve kristalleştirme gibi diğer eski yöntemlere göre fazlaca avantajı vardır. Çok bileşenli bir karışım içeriğindeki maddelerin sayısı, miktarı, yapısı bilinmese bile bu yöntemle büyük oranda saf bir şekilde elde edilebilir.
Sıklıkla kullanılmakta olan bir diğer teknik ise SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis) yöntemidir. Proteinleri moleküler ağırlığına göre ayırmak için kullanılır. SDS iyonik bir deterjandır. Proteinlerin ikincil ve üçüncül yapılarını bozar ve tamamen negatif yükle yüklenmesini sağlar. Daha sonrasında yükleme tamponu (loading buffer) eklenir ve 95°C de inkübe edilir. SDS ve ısı inkübasyonu sayesinde Van Der Walls ve iyonik bağlar kopar ve protein denatüre edilir. 2 farklı pH’da jel hazırlanır ve hazırlanan jeller elektroforez tankına alınır. Tanka elektrik akımı gönderilerek proteinlerin eksiden artıya doğru hareketi sağlanır. Küçük moleküller daha hızlı hareket edeceği için tankın alt kısmına yerleşirler. Renksiz olan protein numunelerinin daha kolay analizi için Western Blot, Coomassie Staining ve Silver Staining gibi yöntemler kullanılır.
Editör : Merve Koçoğlu